Helyszín: Róma, a spanyol megszállás idején

Idő: 1800. június

Helyszín: Sant'Andrea della Valle templom

Az Angyalvárból megszökött politikai fogoly Angelotti, a Római Köztársaság egykori konzulja a Sant'Andrea della Valle templomba menekül, ahol családja egy kápolnát tart fenn. A kápolnában nővére, Attavanti márkinő női ruhákat rejtett el, hogy azokban szökhessen. Angelotti a közeledő sekrestyés elől a kápolnába menekül. Megérkezik Mario Cavaradossi is, aki egy Magdolnát ábrázoló képet fest a templomnak. Magdolnát Angelotti nővéréről mintázta. A sekrestyés segít Cavaradossi munkájában, majd távozik. Angelotti előjön rejtekhelyéről, és elmeséli Cavaradossinak, miként szabadult az Angyalvárból. Cavaradossi felajánlja segítségét a félelemtől reszkető, az éhségtől legyengült embernek. Beszélgetésüket Tosca érkezése szakítja meg. Angelotti ismét elrejtőzik, Cavaradossi egy kosárban nekiadja ebédjét, hogy erőre kapjon. A féltékeny énekesnő meghallotta, hogy a festő valakivel beszélget, és ezt szóvá is teszi. Féltékenysége főleg akkor kap lángra, amikor a festményen felismeri Attavanti márkinőt. Cavaradossi megnyugtatja, és biztosítja szerelméről. Az énekesnő távozása után Angelotti ismét előjön rejtekhelyéről. Cavaradossi felajánlja neki a házát, és azt javasolja, hogy veszély esetén a kerti kútban rejtőzzék el. Ágyúlövés jelzi, hogy rabok szöktek meg az Angyalvárból. Angelotti és Cavaradossi sietve távozik. A templomba érkezik Scarpia, Róma rendőrfőnöke. Segédje, Spoletta megtalálja a kápolnában az üres kosarat és a női ruhákat (többek közt egy legyezőt is). A templom megtelik Te Deumra készülő papokkal és hívőkkel. Tosca visszatér, de nem találja szerelmét. Scarpia kihasználja az énekesnő féltékenységét, és megmutatja neki Attavanti márkinő legyezőjét, majd szerelmet vall az idegesen távozó énekesnőnek.

Helyszín: Farnese-palota

Scarpia a Farnese-palota felső szintjén lévő dolgozószobájában várja kémeit. Amíg vacsoráját fogyasztja, a nyitott ablakon behallatszik az ünnepi kantáta, Tosca csengő éneke. Spoletta jelenik meg. Angelottit nem találták, viszont elfogták a szökését nyilvánvalóan segítő festőt. Cavaradossi mindent tagad, ezért Scarpia elrendeli kínvallatását. Amint elkezdik, bekísérik Toscát is, mert a Cavaradossihoz fűződő kapcsolatát ismerő rendőrfőnök előrelátóan idekérette őt is. Az asszony egy idő után nem tudja hallgatni tovább kedvese jajgatását, és elárulja Angelotti rejtekhelyét. Nem sejti, hogy ezzel nemcsak szerelmese sorsát pecsételte meg, hanem a sajátját is. Elővezetik a szenvedéstől alig támolygó festőt, és a rendőrfőnök előtte utasítja embereit az asszonytól hallottak alapján: Angelottit a kertben, a kiszáradt kútban találják. Cavaradossi éktelen dühvel támad Toscára. Amikor meghallja, hogy Napóleon győzött Marengónál, örömujjongásban tör ki, amivel végleg elárulja, hogy a bukott köztársasággal szimpatizál. A hírt hamarosan módosítják: a csata Napóleon vereségével, a szövetséges erők győzelmével ért véget. A megtört festőt elvezetik, ítélete nem kérdéses: halál. Tosca végső kétségbeesésében ajánlatot tesz az őt szerelmével egyre hevesebben üldöző Scarpiának: övé lesz, ha megkíméli kedvese életét és menlevelet ad kettőjüknek, amivel elhagyhatják a várost. Scarpia hívatja embereit, akikkel közli, hogy Cavaradossi ítélete golyó általi halál, majd nyomatékosan elismétli: az ítéletet ugyanúgy hajtsák végre, mint Palmieri grófét. Tosca hite szerint ez azt jelenti, hogy vaktölténnyel lőnek; nem sejti, hogy Palmierit kivégezték. Ezután menlevelet ír: az énekesnő és egy őt kísérő személy bántatlanul elhagyhatja a palotát és a várost. Amikor átnyújtja a sebtében aláírt papírt, és cserébe jutalmát kéri, Tosca az asztalon talált késsel szíven szúrja.

Helyszín: Angyalvár (Castel Sant’Angelo)

Cavaradossi utolsó óráját tölti. Börtönébe behallatszik a pásztor éneke. Papírt és tollat hoznak, hogy búcsúlevelet írhasson. Váratlanul látogatója érkezik: Tosca az, aki megvesztegette az őröket, hogy beszélhessen kedvesével. A festő borzadva hallgatja a történteket, Scarpia megölését. Az első döbbenet után hálával telve szorítja magához a kezet, amely helyette megtette azt, aminek már régen meg kellett volna történnie. Majd – sorsa kedvező fordulatában nemigen bízva – újra átéli, mint ismerkedett meg Toscával, milyen szép napokat töltöttek együtt. Kattan a zár, nyílik az ajtó, és megérkeznek az őrök, hogy az Angyalvár tetőteraszára, a vesztőhelyre kísérjék Cavaradossit. Tosca biztatja: ha eldördül a lövés, színleljen halált, essen össze, aztán, ha a katonák távoztak, keljen föl, és szabad az út előttük. Kisvártatva hallja a sortüzet, majd az osztag elvonulását. Szólongatni kezdi földön fekvő kedvesét, de mert az nem felel, rosszat sejtve odasiet hozzá. Amint meglátja Cavaradossi golyó szaggatta, élettelen testét, zaj hallatszik: megtalálták Scarpiát, és emberei most feltételezett gyilkosa, Tosca nyomába eredtek. Az énekesnő kiutat nem látván leszámol életével, és a mélybe veti magát.